ANALISIS SDS-PAGE
SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) merupakan teknik untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul
dengan cara dialiri arus listrik (Brooker, 2009). Pada Western Blotting, SDS-PAGE merupakan tahap awal pemisahan protein
sebelum protein ditransfer pada membrane PVDF. Pada elektroforesis 2D (2
Dimensi), SDS-PAGE berfungsi sebagai dimensi kedua sesudah protein dipisahkan
berdasarkan titik isoelektriknya menggunakan isoelectric focusing (IEF). Pada prosedur purifikasi protein,
SDS-PAGE dipakai sebagai salah satu prosedur untuk menilai tingkat kemurnian
protein (Fatchiyah et al, 2011).
Protein yang akan dianalisis, diekstraksi dari sel hidup.
Protein dilarutkan dalam SDS (Sodium
Dedocyl Sulfate) yang berfungsi merusak struktur tiga dimensi pada protein
dengan terpecahnya ikatan disulfida yang selanjutnya direduksi menjadi gugus
sulfidhidril. SDS akan berikatan dengan protein dan memberikan muatan negatif
(-) karena gugus-gugus anionik dari SDS (Hemes, 1998). Kompleks protein
dimasukkan dalam sumuran gel dan dialiri arus listrik untuk memisahkan protein
berdasarkan berat molekul. Protein bermuatan negatif dipisahkan pada membran yang
terbuat dari poliakrilamida (Brooker, 2009).
Gel poliakrilamida yang digunakan analisis SDS-PAGE
terdiri dari 2 yaitu stacking gel dan
separating gel. Stacking gel berfungsi sebagai tempat meletakkan sampel, sedangkan separating gel merupakan tempat
pemisahan protein yang mana protein akan bergerak menuju anoda. Kedua gel
memiliki komponen yang sama, yang membedakan hanya konsentrasi gel poliakrilamida
pembentuknya, yang mana konsentrasi gel pada stacking gel lebih rendah daripada separating gel. Komponen penyusun gel poliakrilamida diantaranya:
- Akrilamida, sebagai senyawa utama penyusun gel dan merupakan senyawa karsinogenik.
- Amonium Persulfat (APS), berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan akrilamida agar bereaksi dengan akrilamida lainnya untuk membentuk rantai polimer yang panjang.
- N,N,N’,N’ tetrametilendiamin (TEMED), berfungsi sebagai katalisator reaksi polimerisasi akrilamida menjadi gel poliakrilamida sehingga dapat digunakan dalam pemisahan protein (Saputra, 2014).
Keunggulan penggunaan gel
poliakrilamida antara lain: tidak bereaksi dengan sampel, tidak membentuk
matriks dengan sampel, tidak menghambat pergerakan sampel dan mempunyai daya
pemisahan yang cukup tinggi (Saputra, 2014).
Gambar 6. Pemisahan Protein
dengan SDS-PAGE
(Sumber: ww2.chemistry.gatech.edu)
