ANALISIS SDS-PAGE

 ANALISIS SDS-PAGE

SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) merupakan teknik untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul dengan cara dialiri arus listrik (Brooker, 2009). Pada Western Blotting, SDS-PAGE merupakan tahap awal pemisahan protein sebelum protein ditransfer pada membrane PVDF. Pada elektroforesis 2D (2 Dimensi), SDS-PAGE berfungsi sebagai dimensi kedua sesudah protein dipisahkan berdasarkan titik isoelektriknya menggunakan isoelectric focusing (IEF). Pada prosedur purifikasi protein, SDS-PAGE dipakai sebagai salah satu prosedur untuk menilai tingkat kemurnian protein (Fatchiyah et al, 2011).

Protein yang akan dianalisis, diekstraksi dari sel hidup. Protein dilarutkan dalam SDS (Sodium Dedocyl Sulfate) yang berfungsi merusak struktur tiga dimensi pada protein dengan terpecahnya ikatan disulfida yang selanjutnya direduksi menjadi gugus sulfidhidril. SDS akan berikatan dengan protein dan memberikan muatan negatif (-) karena gugus-gugus anionik dari SDS (Hemes, 1998). Kompleks protein dimasukkan dalam sumuran gel dan dialiri arus listrik untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul. Protein bermuatan negatif dipisahkan pada membran yang terbuat dari poliakrilamida (Brooker, 2009). 

Gel poliakrilamida yang digunakan analisis SDS-PAGE terdiri dari 2 yaitu stacking gel dan separating gel. Stacking gel berfungsi sebagai tempat meletakkan sampel, sedangkan separating gel merupakan tempat pemisahan protein yang mana protein akan bergerak menuju anoda. Kedua gel memiliki komponen yang sama, yang membedakan hanya konsentrasi gel poliakrilamida pembentuknya, yang mana konsentrasi gel pada stacking gel lebih rendah daripada separating gel. Komponen penyusun gel poliakrilamida diantaranya:

• Akrilamida, sebagai senyawa utama penyusun gel dan merupakan senyawa karsinogenik.

• Amonium Persulfat (APS), berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan akrilamida agar bereaksi dengan akrilamida lainnya untuk membentuk rantai polimer yang panjang.

• N,N,N’,N’ tetrametilendiamin (TEMED), berfungsi sebagai katalisator reaksi polimerisasi akrilamida menjadi gel poliakrilamida sehingga dapat digunakan dalam pemisahan protein (Saputra, 2014).

Keunggulan penggunaan gel poliakrilamida antara lain: tidak bereaksi dengan sampel, tidak membentuk matriks dengan sampel, tidak menghambat pergerakan sampel dan mempunyai daya pemisahan yang cukup tinggi (Saputra, 2014).

Gambar 6. Pemisahan Protein dengan SDS-PAGE 

 (Sumber: ww2.chemistry.gatech.edu)